摘 要

生物制藥CMC通常包含四個(gè)模塊：上游培養(yǎng)、下游純化、制劑灌裝和分析質(zhì)控。下游純化是將上游得到的細(xì)胞培養(yǎng)液澄清后，進(jìn)行純化生產(chǎn)從而得到原液的過(guò)程。

那么為了在固定的工藝下使產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到預(yù)期，就需要確認(rèn)工藝參數(shù)的操作范圍，通過(guò)工藝設(shè)計(jì)來(lái)控制對(duì)藥品安全性和有效性有顯著影響的關(guān)鍵屬性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)是一種設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并分析所獲得信息的技術(shù)。這種技術(shù)可以使我們?cè)谧钚?shù)量的實(shí)驗(yàn)中建立實(shí)驗(yàn)參數(shù)與結(jié)果的數(shù)學(xué)模型，找到最佳工藝條件，確定工藝的操作窗口。

本期皓奇星我們便來(lái)介紹一下DOE的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及其在下游層析工藝中的應(yīng)用。

01

什么是DOE？

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE，Design Of Experiment)，是研究和處理多因子與響應(yīng)變量關(guān)系的一種方法。它通過(guò)合理地挑選實(shí)驗(yàn)條件，安排實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，從而建立響應(yīng)與因子之間的函數(shù)關(guān)系，或者找出總體最優(yōu)的改進(jìn)方案。它可以用最少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量得到最大的信息量并可以發(fā)現(xiàn)各個(gè)因子之間的交互作用，探索整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)間。

在工藝開發(fā)期間，利用DOE的實(shí)驗(yàn)方法我們可以在眾多影響響應(yīng)值Y值的因子X(jué)中確定哪些對(duì)響應(yīng)有顯著影響，確定如何改變這些因子的取值使響應(yīng)達(dá)到最佳值。DOE實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析獲得傳遞函數(shù)，得到Y(jié)與各因子X(jué)的關(guān)系式。采用DOE的方法，因子X(jué)的范圍選擇廣，且可以進(jìn)行精確的控制，這也使得DOE實(shí)驗(yàn)可以探索到整體的最佳方案，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果取得突破性的改善。

02

DOE的基本術(shù)語(yǔ)

因子：所有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的參數(shù)。通?？杀豢刂?，但也可能不可控制即噪聲因子。該參數(shù)既可以是數(shù)值也可以為種類，比如層析過(guò)程中的pH、電導(dǎo)率、鹽類型、填料種類等。

響應(yīng)：一個(gè)或多個(gè)可測(cè)量的變量描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比如層析過(guò)程中的回收率、純度、HCP含量等。

模型/傳遞函數(shù)：在變量統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上建立的數(shù)學(xué)模型?？梢悦枋龉に噮?shù)X與響應(yīng)值Y的關(guān)系，并對(duì)不可測(cè)量的因子采用預(yù)測(cè)響應(yīng)，可以量化隨機(jī)變化的大小。

下圖列舉了部分層析過(guò)程中涉及到的因子X(jué)和響應(yīng)值Y。

03

DOE的一般步驟

●?明確目的，通過(guò)歷史數(shù)據(jù)或經(jīng)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。

●?確定實(shí)驗(yàn)的輸出結(jié)果響應(yīng)值Y；確定因子X(jué)及其水平。

●?確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)因子X(jué)的實(shí)際取值，并確定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。

●?按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃隨機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并測(cè)量輸出值Y。

●?整理、分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析和回歸分析。找出主要影響因素并確定因子X(jué)和響應(yīng)Y的關(guān)系式。

●?確定最優(yōu)的因子組合。

●?在最優(yōu)的因子組合范圍內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行驗(yàn)證。

04

DOE常見設(shè)計(jì)優(yōu)缺點(diǎn)比較

05
案例分析

在皓陽(yáng)生物某融合蛋白的親和捕獲過(guò)程中，由于細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白表達(dá)量高且聚集體含量較高，很難達(dá)到親和洗脫液HPLC-SEC純度和回收率的平衡的情況。于是，采用DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行洗脫條件的優(yōu)化，試圖找到回收率和HPLC-SEC純度均大于90%的工藝操作窗口。

首先，確定響應(yīng)值Y為回收率和HPLC-SEC純度；根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定因子X(jué)為洗脫緩沖液的pH（范圍3.0-3.8）及鹽濃度（范圍20mM-100mM）；選擇響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中CCF模型進(jìn)行2因素2水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了11組實(shí)驗(yàn)（3組中心點(diǎn)）。按照模型列出的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行親和層析，收集洗脫液并進(jìn)行HPLC-SEC純度檢測(cè)和回收率的計(jì)算，將響應(yīng)值Y的結(jié)果回輸并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

DOE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫液pH及鹽濃度均為親和捕獲工藝中純度和回收率的顯著影響因素，在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，pH越高，收率越低，純度越高。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DOE實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)洗脫條件，將層析柱直徑放大至5cm并用該洗脫條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到預(yù)期。最終確定了親和層析洗脫緩沖液pH及鹽濃度區(qū)間范圍，獲得的目標(biāo)蛋白純度>90%，回收率>90%。該工藝經(jīng)過(guò)10L反應(yīng)器培養(yǎng)液進(jìn)行放大驗(yàn)證后，成功應(yīng)用于3批200L中試生產(chǎn)，工藝方法穩(wěn)定可行。

隨著生物行業(yè)的不斷發(fā)展，產(chǎn)品種類繁多，各種復(fù)雜類型的雙抗和融合蛋白的開發(fā)必將為下游純化工藝帶來(lái)挑戰(zhàn)和考驗(yàn)。結(jié)合實(shí)際需求，善用DOE等實(shí)驗(yàn)工具，相信再荊棘叢生的路，也終究會(huì)豁然開朗，柳暗花明。