1970年，Awdeh等做了一有趣的實(shí)驗(yàn)，用人腫瘤細(xì)胞5563表達(dá)一IgG抗體，他們發(fā)現(xiàn)原本在IEF膠上同質(zhì)的抗體進(jìn)行了脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)十分鐘立刻呈現(xiàn)異質(zhì)性。至此研究者們意識(shí)到酶催化和非酶催化的翻譯后修飾和降解均能引起抗體異質(zhì)性，例如錯(cuò)配二硫鍵、糖基化、N端谷氨酰胺環(huán)化、C端賴氨酸剪切、脫酰胺、氧化、糖化、肽鍵斷裂。而后眾多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)抗體的異質(zhì)性在細(xì)胞內(nèi)加工、細(xì)胞外處理、純化過(guò)程及儲(chǔ)存過(guò)程均能引入，抗體的異質(zhì)性是不可避免的。因而也需運(yùn)用多種不同原理的分析方法去分析抗體的異質(zhì)性。異質(zhì)性又可繼續(xù)細(xì)分為電荷異質(zhì)性、疏水異質(zhì)性、分子大小異質(zhì)性、高級(jí)結(jié)構(gòu)異質(zhì)性等。其中電荷異質(zhì)性監(jiān)測(cè)被認(rèn)為是監(jiān)控翻譯后修飾最靈敏的方法。

1

?電荷變異體的概念

由于表面凈電荷和電荷分布的差異，導(dǎo)致色譜、電泳行為產(chǎn)生差異，這些存在電荷異質(zhì)性的蛋白常被稱為電荷變異體（藥典委翻譯，后續(xù)以此作為標(biāo)準(zhǔn)叫法）或電荷異構(gòu)體（Charge Variant）。等電聚焦電泳（IEF）或毛細(xì)管等電聚焦電泳（cIEF）中，相對(duì)主峰（Main），酸性變異體（Acidic）是pI較低的一類組分，堿性變異體(Basic)則是pI更高的組分。若是采用CEX分析，酸性變異體則在主峰之前被洗脫，堿性變異體比主峰洗脫更晚，AEX和CZE分析則相反。

2

電荷變異體的來(lái)源分類

2.1 主峰并非是未經(jīng)修飾或未發(fā)生降解的抗體，事實(shí)上主要由以下三種典型的翻譯后修飾構(gòu)成。

表1 主峰產(chǎn)生原因?

序號(hào)	產(chǎn)生原因	影響
1	N端環(huán)化成焦谷氨酸 （N-terminal PyroGlu）	無(wú)影響
2	C端賴氨酸缺失 (C-terminal Lys Clipping)	CDC
3	N糖基化中性糖鏈 (N-Glycosylation)	PK，ADCC，CDC，穩(wěn)定性

2.2 酸性變異體的形成原因主要是堿性基團(tuán)的缺失、酸性基團(tuán)的引入、構(gòu)象改變及其他與CEX柱結(jié)合能力降低的修飾等。

?表2?酸性變異體產(chǎn)生原因

序號(hào)	產(chǎn)生原因	影響
1	唾液酸 (Sialic Acid)	PK，ADCC，免疫原性
2	天冬酰胺及谷氨酰胺脫酰胺 (Deamidation)	結(jié)合活性，效價(jià)
3	二硫鍵被還原 (Reduced Disulfide Bonds)	穩(wěn)定性，效價(jià)
4	游離巰基發(fā)生半胱氨酸化 (Cysteinylation)	穩(wěn)定性，生物學(xué)活性
5	賴氨酸糖化 （Glycation）	聚集
6	O糖基化 （O-Glycosylation）	結(jié)合活性，穩(wěn)定性，PK
7	琥珀酰亞胺（天冬酰胺） （Succinimide from Asn）	結(jié)合活性，效價(jià)
8	二硫鍵錯(cuò)配 (Disulfide Bond Scramble)	生物學(xué)活性，穩(wěn)定性，效價(jià)
9	三硫鍵 (Thiosulfide Modification)	無(wú)影響
10	馬來(lái)酸酰脲 （Maleuric Acid）	未知
11	檸檬酸修飾 (Citric Acid Modification)	未知
12	丙酮醛修飾 (Methylglyoxal)	未知
13	硫醚鍵 (Thioether Linkage)	未知

2.3 堿性變異體的形成原因主要是堿性基團(tuán)不完全切除、額外堿性基團(tuán)的引入、構(gòu)象改變及其他與CEX柱結(jié)合能力增加的修飾等。

表3?堿性變異體產(chǎn)生原因

序號(hào)	產(chǎn)生原因	影響
1	C端賴氨酸不完全切除 (C-terminal Lys )	CDC
2	N端谷氨酰胺環(huán)化不完全 (N-terminal Gln )	無(wú)影響
3	脯氨酸酰胺化 (Proline Amidation)	無(wú)影響
4	絲氨酸突變成精氨酸 (Ser Mutation to Arg )	未知
5	琥珀酰亞胺（天冬氨酸） (Succinimide from Asp)	結(jié)合活性，效價(jià)
6	N糖糖基化缺失 (Aglycosylation)	PK，ADCC，CDC，穩(wěn)定性
7	谷胱甘肽修飾 (Glutathionylation)	穩(wěn)定性，生物學(xué)活性

2.4???還有很多修飾或者降解，其引起的電荷變化不固定。

表4? 電荷不固定的修飾或降解情況匯總表

序號(hào)	產(chǎn)生原因	影響
1	蛋氨酸、色氨酸、組氨酸氧化 (Met、Trp、His Oxidation)	穩(wěn)定性，PK，結(jié)合活性
2	碎片 (Fragments)	生物學(xué)活性，PK，免疫原性
3	聚體 (Aggregates)	生物學(xué)活性，免疫原性，效能
4	天冬氨酸異構(gòu)化 (Iso-Asp)	結(jié)合活性，效價(jià)
5	信號(hào)肽不完全切除 (Incomplete Removal of Signal Peptide)	未知
6	高甘露糖 (High Mannose)	PK，ADCC，CDC
7	氨基酸突變 (Amino Acid Mutation)	未知

其中關(guān)于高甘露糖，有研究者發(fā)現(xiàn)酸性變異體中富集大量高甘露糖糖型，此糖型雖為中性糖，但其可能因?yàn)楦淖兞说鞍讟?gòu)象，進(jìn)而影響了蛋白與離子交換柱的結(jié)合而使高甘露糖修飾的蛋白呈現(xiàn)酸性變異體性質(zhì)；另有研究結(jié)果顯示在堿性變異體中甘露糖修飾大量富集，但有研究者單獨(dú)研究含高甘露糖糖型的Fc段與聚體或電荷變異體的形成，兩者又無(wú)顯著相關(guān)性。甘露糖型與電荷異質(zhì)性的影響仍需進(jìn)一步研究。

為了更清晰的呈現(xiàn)這些修飾或降解對(duì)電荷的影響，此處引用張伯彥先生之前培訓(xùn)的一張PPT。具體的翻譯后修飾成因和影響，將在下一期詳細(xì)解讀。

3?

電荷變異體對(duì)抗體藥物功能影響

電荷變異體的產(chǎn)生會(huì)影響抗體藥物的結(jié)合能力（Binding）、生物學(xué)活性（Bioactivity）、藥代動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetic）、免疫原性（Immunogenicity）以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（Stability）等，進(jìn)而會(huì)影響藥物的有效性和安全性。2.1-2.4表格中已經(jīng)對(duì)有文獻(xiàn)報(bào)道的各個(gè)修飾或降解易產(chǎn)生的影響進(jìn)行了歸納總結(jié)，但具體情況還是需要根據(jù)修飾所在位點(diǎn)進(jìn)行具體分析。

3.1?電荷變異體對(duì)于藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響

⑴??有研究者利用化學(xué)修飾方式增加抗體正負(fù)電荷基團(tuán)，結(jié)果顯示改變蛋白和細(xì)胞表面靶點(diǎn)的結(jié)合，從而影響組織穿透性、組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)。

⑵??基因泰克公司曾對(duì)上市抗體及臨床前抗體藥物關(guān)于電荷變化產(chǎn)生的藥代方面的影響做過(guò)一個(gè)總結(jié)，結(jié)果表明：①當(dāng)電荷變異超過(guò)一個(gè) pH 單位時(shí)，會(huì)影響藥物的組織分布及藥代動(dòng)力學(xué)；②增加正電荷，會(huì)提高藥物的組織蓄積，提高血漿清除率（Blood Clearance）；③降低正電荷，會(huì)減少藥物的組織蓄積，提高藥物全身總清除率(Body Clearance)。此結(jié)論也被Zheng等其他研究者證實(shí)，pI值高的抗體呈現(xiàn)更高的血漿清除率，導(dǎo)致抗體半衰期降低；對(duì)于皮下注射的藥物也會(huì)降低其生物利用度。

⑶? 值得注意的是，這些變異體均是通過(guò)人為修飾且大量富集某一特定修飾組分得到的。多種修飾混合組成的酸堿性變異體（pI=8.7-9.1）與目的組分或原材料相比，在與FcRn結(jié)合能力、PK數(shù)值及生物學(xué)效能方面并未呈現(xiàn)顯著差異，只是酸性變異體與FcRn的結(jié)合能力及生物學(xué)效能略下降，但均在方法波動(dòng)范圍內(nèi)。而Gandhi等的研究顯示酸性變異體與FcRn結(jié)合能力與目的組分相當(dāng)；堿性組分由于富集了大量聚體，增加了總親合力，與FcRn的結(jié)合能力更強(qiáng)。Jan Visser等也富集了末端脯氨酸酰胺化的抗體(9%)與原低含量組分進(jìn)行了生物學(xué)活性（結(jié)合、ADCC和CDC）、藥代動(dòng)力學(xué)（AUC 、Cmax）、毒理實(shí)驗(yàn)等對(duì)比研究，未顯示有顯著差異。

⑷? 或許由于翻譯后修飾成分與比例的不同，或許是對(duì)pI的貢獻(xiàn)不同及pI變化程度不大，導(dǎo)致酸堿變異體在藥物代謝方面的影響程度不同而呈現(xiàn)不完全類似的結(jié)果，這些均有待近一步研究考證。

4?

電荷變異體定量分析方法概述

如前述所說(shuō)，色譜法和電泳法是兩種最常用的電荷變異體分析方法，也是目前2015版中國(guó)藥典收錄的兩大類用于電荷異質(zhì)性分析的方法，主要包括離子交換色譜（IEC）、等電聚焦電泳（IEF）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（cIEF）。

4.1離子交換色譜

離子交換色譜可分為陰離子交換色譜（AEX）和陽(yáng)離子交換色譜（CEX）。由于大部分抗體都是弱堿性，CEX最為常用的。離子交換方法耐用、分辨率高且不需要特殊專用儀器（高效液相即可），還可以放大用于分離制備電荷變異體做更深入的研究，曾被認(rèn)為是分析電荷變異體的金標(biāo)準(zhǔn)方法。其優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下表5。

4.2電泳法

電泳法包括等電聚焦電泳（IEF）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（cIEF）。

4.2.1 平板等電聚焦電泳（IEF）因操作繁瑣、分辨率低且定量不準(zhǔn)確，已逐步被毛細(xì)管電泳替代。

4.2.2 目前cIEF又根據(jù)成像和檢測(cè)的差異區(qū)分成傳統(tǒng)cIEF（需用壓力或改變檢測(cè)器末端電極槽儲(chǔ)備液的pH值的方法使溶質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器）和全柱成像等電聚焦毛細(xì)管電泳（icIEF，采用全柱成像方式進(jìn)行檢測(cè)）。icIEF方法由于聚焦完成后不需要遷移，相比傳統(tǒng)cIEF有明顯的優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)在下表5。在2019年3月6日，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《關(guān)于單抗電荷變異體測(cè)定法（icIEF法）標(biāo)準(zhǔn)草案的公示》，擬收錄icIEF法作為測(cè)定電荷變異體藥典標(biāo)準(zhǔn)方法。

4.2.3 ?CZE的方法由于使用簡(jiǎn)單的分離緩沖體系和非涂層毛細(xì)管，制樣過(guò)程簡(jiǎn)單、方法通用性好，同時(shí)可得到高分辨率和高重現(xiàn)性的分離結(jié)果，目前也被廣泛用于鑒定及電荷異質(zhì)性檢測(cè)。

4.3電荷變異體定量結(jié)果差異

4.3.1 大部分情況下，電荷變異體基于等電聚焦和色譜分離兩種方式上行為一致，但由于分離機(jī)理的差異，有時(shí)存在細(xì)微差異。IEF或cIEF分離電荷變異體基于凈電荷差異（Overall Charge Difference ，Apparent pI）；IEC除了凈電荷的作用，電荷分布、蛋白幾何結(jié)構(gòu)（Distribution of Charge）在分離過(guò)程也中起重要作用；IEF和IEC在表征電荷變異體時(shí)存在的差異現(xiàn)象已被證明。如天冬氨酸異構(gòu)化后pI不會(huì)改變，在IEC的行為由于構(gòu)象差異會(huì)產(chǎn)生變化。而CZE是基于蛋白電荷和流體力學(xué)尺寸（Hydrodynamic Size）差異導(dǎo)致變異體遷移率不同，機(jī)理和呈現(xiàn)的結(jié)果與另外兩類方法存在差異。

4.3.2 源于方法的不同以及分離度差異，目前報(bào)道的四種方法對(duì)于同一蛋白的定量結(jié)果是有差異的（如圖4），同時(shí)因蛋白不同，酸堿變異體組成和比例也不同，因而不需要像關(guān)注聚集體那樣限定絕對(duì)值，而是監(jiān)測(cè)相關(guān)CQA峰的比例差異即可。四種方法中何種方法分辨率最高，也因?qū)嶋H情況而定。

5

電荷變異體表征方法概述

5.1酶解對(duì)比

應(yīng)用對(duì)應(yīng)酶進(jìn)行酶解，對(duì)比酶解前后的變化對(duì)峰進(jìn)行定性。如CPB酶切可確定K變異體；唾液酸酶酶切可確定唾液酸峰；Endo-S或PNGase-F酶切可確定N糖引起的變異體等。該方法簡(jiǎn)單快速，但只可鑒定特定的修飾。

5.2IEC-MS 或CE-MS直接表征

利用揮發(fā)性鹽開(kāi)發(fā)IEC方法，調(diào)整液相聯(lián)用系統(tǒng)相關(guān)部件，可對(duì)分離的電荷變異體直接進(jìn)行質(zhì)譜分析；另一方面，近幾年不斷發(fā)展的毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已實(shí)現(xiàn)抗體經(jīng)cIEF或CZE分離后直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)[i]。此兩種方法均可實(shí)現(xiàn)電荷變異體分離后實(shí)時(shí)完整分子量鑒定，表征不同電荷變異體的分子量差異，如相差128Da則可判定為賴氨酸變異體；也可用于快速監(jiān)測(cè)抗體穩(wěn)定性試驗(yàn)中產(chǎn)生翻譯后修飾變化。另一方面，結(jié)合各類酶酶解試驗(yàn)，去除特定的翻譯后修飾干擾，亦可進(jìn)一步表征其他電荷變異體翻譯后修飾情況。當(dāng)然該方法仍有局限性，一是該方法只能從完整分子量或亞基層面進(jìn)行測(cè)定，分子量較大，對(duì)于分子量差別小的翻譯后修飾情況，定性誤差較大；二是和先分離收集組分再分析相比，無(wú)法同時(shí)提供活性檢測(cè)樣品；三是蛋白的高糖基化修飾會(huì)影響質(zhì)譜響應(yīng)值，且糖基化修飾比例復(fù)雜，會(huì)增加定性分析難度。

5.3分離收集后表征

應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x并富集電荷純度較高的電荷變異體，進(jìn)而利用多種分析手段全面檢測(cè)電荷變異體的差別，比如翻譯后修飾、生物學(xué)活性、高級(jí)結(jié)構(gòu)、藥代動(dòng)力學(xué)等。目前文獻(xiàn)報(bào)道的分離收集方法主要有以下三種。

5.3.1??IEC-HPLC分離收集：通過(guò)分段收集或柱體積等比放大后分段收集，再進(jìn)行濃縮換液得到電荷純度較高的電荷變異體。該方法可利用已確定的IEC-HPLC方法直接進(jìn)行分離，但分離量低，收集精度差，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)變異體峰進(jìn)行分離富集，富集過(guò)程耗時(shí)耗力。

5.3.2 ?置換色譜（Displacement Chromatography）分離收集：抗體與離子交換色譜柱結(jié)合后，用另一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑（Displacer）通入色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。最終抗體中的電荷變異體按作用力強(qiáng)弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，流出色譜柱，得以分離電荷變異體。Zhang等采用Sachem Expell SP1置換劑，并通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜成功分離IgG1電荷異構(gòu)體，各組分回收率>70%，電荷純度>90%。該方法上樣量大、產(chǎn)率高、分辨率好，正逐步被應(yīng)用于生物分子的制備性分離與純化。但置換劑、固定相、流動(dòng)相的選擇均是關(guān)鍵參數(shù)，各參數(shù)均需要進(jìn)行大量?jī)?yōu)化工作。?

圖 6? 置換色譜分離圖譜

5.3.3?自由流電泳（Free Flow Electrophoresis，F(xiàn)FE）分離收集：與上述兩種基于色譜分離原理的收集方式相比，自由流電泳是一種基于等電聚焦電泳原理的電荷變異體分離制備工具。自由流電泳的分離單元（可以對(duì)應(yīng)色譜法中的色譜柱）本質(zhì)為一個(gè)腔體。當(dāng)緩沖液（兩性電解質(zhì)）從一端往另一端流動(dòng)的同時(shí)，在流動(dòng)方向的兩側(cè)加上電壓，在流動(dòng)方向的垂直方向形成pH梯度。待分離物質(zhì)以恒定濃度和流速隨著緩沖液流入端注入分離單元，一方面在電壓和pH梯度的作用下等電聚焦，另一方面被緩沖液帶動(dòng)向出口端流動(dòng)，最終出口端通過(guò)96通道流入96孔板。接下來(lái)只需要檢測(cè)96孔板，回收對(duì)應(yīng)孔中的組分，最終實(shí)現(xiàn)不同電荷變異體的分離和富集。自由流電泳可達(dá)到icIEF高分辨率，完成單個(gè)變異體峰分離，同時(shí)單次實(shí)驗(yàn)分離量可以達(dá)到100mg蛋白。但該方法需有特定的儀器，分離過(guò)程需加尿素等促溶劑和兩性電解質(zhì)，最終的樣品也需要進(jìn)行濃縮換液等步驟，蛋白穩(wěn)定性可能會(huì)受影響。

隨著質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念逐步在生物制藥產(chǎn)業(yè)的深入，電荷變異體將是生物藥物研發(fā)、生產(chǎn)中質(zhì)量控制必須考慮的因素。對(duì)電荷變異體進(jìn)行有效分離、鑒定，確認(rèn)變異體對(duì)于藥物功能方面的影響，進(jìn)而對(duì)納入關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的變異體進(jìn)行監(jiān)控，將有助于實(shí)現(xiàn)藥物的安全、有效、質(zhì)量可控。

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