皓陽生物基于可商業(yè)化授權(quán)的CHO-K1細(xì)胞株，結(jié)合自有的質(zhì)粒系統(tǒng)以及細(xì)胞株篩選方案，建立皓越?穩(wěn)定細(xì)胞株平臺，2021年至今已為國內(nèi)外客戶完成超過50個(gè)單抗、雙抗以及融合蛋白穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建項(xiàng)目。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，項(xiàng)目平均表達(dá)量大于6.7g/L，高效助力客戶項(xiàng)目更快更好推進(jìn)。2022年，基于皓越?的基礎(chǔ)上進(jìn)一步打造Fut8敲除的ADCC加強(qiáng)型穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建平臺，為客戶提供更多元的選擇與服務(wù)。

現(xiàn)在，皓陽正式推出“4g保底，挑戰(zhàn)無上限”的穩(wěn)定細(xì)胞株開發(fā)服務(wù)！為對稱結(jié)構(gòu)的單/雙抗提供4g/L的保底細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)。為實(shí)現(xiàn)全球穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建第一品牌的愿景，歡迎客戶將皓陽的服務(wù)同步與國內(nèi)外任何同行做同步對比。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）是一類能識別兩種位點(diǎn)或能與兩種抗原進(jìn)行結(jié)合的非天然抗體結(jié)構(gòu)，從由linker連接的兩個(gè)最小抗原結(jié)合片段，到IgG結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上交聯(lián)額外的結(jié)構(gòu)域的“大型”分子，科學(xué)家們的奇妙構(gòu)思造就了琳瑯滿目的精巧架構(gòu)，賦予了理論上“1+1大于2”的能力——bsAb能表現(xiàn)出單獨(dú)的親本抗體或混合的“雞尾酒療法”不可比擬的性質(zhì)和潛力。如在最為廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域之一——腫瘤的免疫治療上，bsAb能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)位點(diǎn)，發(fā)揮阻斷腫瘤細(xì)胞信號通路，介導(dǎo)免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞等功能，降低單抗的“脫靶”效應(yīng)，減少腫瘤細(xì)胞逃逸。由于bsAb的種種優(yōu)越性，近年來一直受到業(yè)內(nèi)的高度關(guān)注，也成為癌癥，炎癥，自身免疫病等多種疾病的開發(fā)熱點(diǎn)。

隨著行業(yè)發(fā)展，從第一個(gè)上市的Catumaxomab起，Amgen的Blinatumomab和Roche的Emicizumab相繼獲批，近期國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）官網(wǎng)公示，由康方生物自主研發(fā)的PD-1/CTLA-4 雙特異性抗體Candonilimab獲批上市?？梢灶A(yù)見，未來的賽道上涌現(xiàn)的bsAb明星將會越來越多，而將一個(gè)promising的bsAb從實(shí)驗(yàn)室推動到臨床及上市，真正造?；颊?，從CMC的角度，需要高屋建瓴的設(shè)計(jì)與思考。

通過剖析與歸納bsAb的結(jié)構(gòu)，可分為具備Fc區(qū)的IgG-like bsAb及不具備Fc區(qū)的non-IgG-like bsAb，其中IgG-like bsAb又分為對稱（Symmetric）和非對稱結(jié)構(gòu)（Asymmetric）。Catumaxomab和Emicizumab是IgG-like bsAb的典型代表，這類bsAb在CMC上的優(yōu)勢在于溶解性和穩(wěn)定性較好，劣勢在于有些復(fù)雜結(jié)構(gòu)會帶來較高的聚體、錯(cuò)配、得率低等問題；Blinatumomab則屬于non-IgG-like bsAb一類，這類bsAb在CMC上的優(yōu)勢在于結(jié)構(gòu)簡單，一般表達(dá)量較高，劣勢則在于需要開發(fā)特定的純化技術(shù)路線等。

如何能在IND階段順利完成bsAb的開發(fā)工作，需要從以下幾個(gè)重點(diǎn)考慮：

01

細(xì)胞株開發(fā)

基于QbD理念及現(xiàn)實(shí)因素考慮，對于整個(gè)CMC而言，一個(gè)“天資卓越”的細(xì)胞株重要程度不言而喻，它是整個(gè)CMC的起點(diǎn)和基礎(chǔ)。高效穩(wěn)定細(xì)胞株兼具表達(dá)量高，產(chǎn)品質(zhì)量好（錯(cuò)配/聚體低等），穩(wěn)定性好等特性。這些特性直接影響到后續(xù)工藝開發(fā)、生產(chǎn)可及性和生產(chǎn)成本的控制。皓陽在2021~2022年間開發(fā)了15個(gè)bsAb項(xiàng)目，涵蓋7種不同結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)，見圖1。目前針對bsAb的細(xì)胞株開發(fā)，皓陽多維度做了更多的考慮和設(shè)計(jì)，主要體現(xiàn)在表達(dá)載體設(shè)計(jì)、宿主細(xì)胞選擇、檢測方法和篩選方式的設(shè)計(jì)和選擇上。

圖1?bsAb結(jié)構(gòu)-表達(dá)量匯總注：商業(yè)化CD培養(yǎng)基常規(guī)14天Fed-batch培養(yǎng)工藝；紅點(diǎn)為Top clone titer；綠點(diǎn)為Top pool titer。

針對不同結(jié)構(gòu)的bsAb個(gè)性化的載體構(gòu)建策略，在細(xì)胞株開發(fā)早期高通量的檢測bsAb的純度和正配率，在細(xì)胞株篩選過程中確定關(guān)鍵指標(biāo)和技術(shù)點(diǎn)，以盡可能的保障能篩選到表達(dá)較優(yōu)bsAb的細(xì)胞株，一個(gè)Asymmetric formats bsAb開發(fā)實(shí)例如下：
通過轉(zhuǎn)染及高通量minipool篩選，得到一批細(xì)胞群，表達(dá)及質(zhì)量情況如下表

其中minipool?B在正配率和表達(dá)量上較其余minipool有顯著優(yōu)勢，SEC純度在可接受范圍內(nèi)，挑選minipool?B進(jìn)行單克隆篩選，細(xì)胞株表達(dá)及一步親和純化后質(zhì)量情況如下表

由此可見，通過前期獲得正配率較高，表達(dá)量較優(yōu)的細(xì)胞群，后續(xù)篩選出理想的細(xì)胞株概率大幅提升，極大程度的減低了該Asymmetric formats bsAb后續(xù)工藝開發(fā)的難度。

02
上游工藝開發(fā)

誠然，獲得一個(gè)表達(dá)高質(zhì)量蛋白的細(xì)胞株對于bsAb后續(xù)開發(fā)是相對事半功倍的，但往往會存在沒有篩到理想細(xì)胞株的情況。細(xì)胞株開發(fā)是相對耗時(shí)費(fèi)力的限速步驟，反復(fù)重復(fù)該部分工作，結(jié)果的不確定性極大，因此帶來難以考量時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。上游工藝開發(fā)可及時(shí)介入，以期通過后天的培養(yǎng)條件優(yōu)化改善產(chǎn)物質(zhì)量，一個(gè)開發(fā)實(shí)例如下。
如圖1中結(jié)構(gòu)1所展示的Symmetric formats bsAb，由于分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致蛋白分泌時(shí)出現(xiàn)斷裂，且碎片無法經(jīng)純化有效的去除，針對該熱門靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)分子，不同公司采取了不同的處理手段，如通過對細(xì)胞因子序列的改造減少斷裂（WO2018205985A1）。該項(xiàng)目在未經(jīng)序列優(yōu)化的情況下，通過高通量細(xì)胞株篩選對于斷裂情況無有效改善，在選定top clone后，結(jié)合培養(yǎng)基開發(fā)和細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化，成功降低了bsAb斷裂比例，對碎片含量進(jìn)行了有效控制，提高了純化收率。后續(xù)三批中試生產(chǎn)收率達(dá)到65%-70%，與單抗基本一致。

03
下游工藝開發(fā)

與單抗相比，bsAb具有更加多樣化的分子結(jié)構(gòu)與更加復(fù)雜的副產(chǎn)物，如同源二聚?（Homodimer）、重-輕鏈錯(cuò)配（Heterodimeric Fc species）、半抗（Half antibody）、輕鏈二聚體、重鏈二聚體（light chain dimer，heavy chain dimer）等，對下游純化工藝提出了更高的挑戰(zhàn)。現(xiàn)階段bsAb的純化策略依然主要依賴于層析技術(shù)。不同于單抗的經(jīng)典三步層析策略，bsAb沒有固定的純化套路，一個(gè)好的bsAb純化策略需同時(shí)考慮副產(chǎn)物去除、目的蛋白收率、成本以及工藝的可放大性。

快速有效的完成bsAb純化策略研究，首先需要了解目的蛋白的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆。bsAb通常具有特殊的分子設(shè)計(jì)，以提高其正確配對率，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。有時(shí)可以增加bsAb與副產(chǎn)物之間的差異性，提高層析步驟的分辨率；其次根據(jù)已有的平臺方法，選擇合適的層析工藝去除雜質(zhì)；最后整體考量工藝對雜質(zhì)的去除能力，制定純化策略。一般的純化工藝包含捕獲、粗純、精純?nèi)齻€(gè)步驟。在bsAb純化策略的制定上也可對其進(jìn)行借鑒，評估每個(gè)層析工藝對不同雜質(zhì)的去除能力，考慮每個(gè)步驟輸入條件與輸出結(jié)果，有效連接各個(gè)層析工藝，從而達(dá)到制備合格產(chǎn)品的目的。一個(gè)Asymmetric formats bsAb開發(fā)實(shí)例如下。

通過高通量細(xì)胞株篩選，獲得的細(xì)胞株表達(dá)量較高，但蛋白質(zhì)量與原研有所差異。通過下游工藝去除錯(cuò)配體，精純后蛋白質(zhì)量與原研高度相似。

bsAb作為抗體治療領(lǐng)域的新興概念，受到持續(xù)且矚目的關(guān)注。多家企業(yè)已進(jìn)行bsAb的戰(zhàn)略化布局，雖然目前多數(shù)處于研發(fā)階段，但可以預(yù)見后續(xù)的bsAb賽道將會越來越擁擠。而克服bsAb產(chǎn)業(yè)化過程中面臨的種種挑戰(zhàn)，需要各方攜手并進(jìn)，通盤考慮。相信未來會有更多的療效強(qiáng)、副作用低的bsAb進(jìn)入市場，為患者帶來更多的選擇和希望。

參考文獻(xiàn)

[1] Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. Nat Rev Drug Discov 18, 585–608 (2019). https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1[2] A roadmap for lgG-like bispecific antibody purification,DOI:10.1016/B978-0-08-103019-6.00008-4,(2020)[3] Alkaline cation-exchange chromatography for the reduction of aggregate and a mis-formed disulfide variant in a bispecific antibody purification process,?DOI:10.1016/j.jchromb.2014.11.002,(2015)[4] Analytical characterization of a monoclonal antibody therapeutic reveals a three-light chain species that is efficiently removed using hydrophobic interaction chromatography,?DOI:10.4161/mabs.26192,(2013)[5] Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies,?DOI:10.1093/abt/tbab007,(2021)

關(guān)于皓陽生物

杭州皓陽生物技術(shù)有限公司成立于2015年，專注于為抗體/重組蛋白客戶提供早期成藥性評估、抗體藥物偶聯(lián)開發(fā)、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建、工藝開發(fā)、中試生產(chǎn)、IND申報(bào)和臨床樣品生產(chǎn)，培養(yǎng)基開發(fā)定制等多平臺一站式研發(fā)服務(wù)。在上海杭州兩地設(shè)有研發(fā)中心和生產(chǎn)基地，目前擁有員工200余人。上海研發(fā)中心依托多種分析手段和瞬時(shí)表達(dá)平臺為客戶提供從人源化設(shè)計(jì)，活性分析到成藥性分析多維度的分子設(shè)計(jì)和評估。杭州中心擁有自主開發(fā)可授權(quán)的高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株平臺（皓越）和工藝開發(fā)平臺，建有完善的250L和500L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠在8個(gè)月左右提供從DNA到毒理批樣品交付，12-15個(gè)月內(nèi)完成IND申報(bào)準(zhǔn)備工作。同時(shí)公司還在建6*2000L商業(yè)化生產(chǎn)線，預(yù)計(jì)于2024年底陸續(xù)投入使用。皓陽生物致力于通過幫助新藥研發(fā)，推動生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新為民、科技惠民的目標(biāo)。
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