中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞作為重組蛋白生產(chǎn)的重要宿主細(xì)胞之一，隨著細(xì)胞系開(kāi)發(fā)和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，其生產(chǎn)水平已大幅提高。但一直以來(lái)，我們對(duì)于細(xì)胞內(nèi)重組蛋白生產(chǎn)的分泌機(jī)制知之甚少。特別是隨著新一代生物制劑的開(kāi)發(fā)，復(fù)雜而難以表達(dá)的（DTE，difficult-to-express）重組蛋白數(shù)量也大大增加了。為了提高各種重組蛋白的生產(chǎn)，有必要了解蛋白分泌途徑中可能的限速步驟。

結(jié)合本公司瞬轉(zhuǎn)制備業(yè)務(wù)平臺(tái)大量的抗體、融合蛋白、抗原蛋白的制備實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本文探討CHO細(xì)胞分泌途徑中導(dǎo)致重組蛋白低效分泌和聚集的瓶頸，和當(dāng)前所使用的解決策略。

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CHO細(xì)胞內(nèi)重組蛋白的分泌途徑

CHO細(xì)胞內(nèi)，重組蛋白的分泌起始于多肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移。新合成的肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后，進(jìn)行折疊和成熟，然后通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽，運(yùn)輸?shù)礁郀柣w上，進(jìn)行聚糖延伸或磷酸化修飾等，最后分泌到胞外（圖1）。嚴(yán)格的質(zhì)量控制機(jī)制，包括未折疊蛋白反應(yīng)（UPR，unfolded protein response）和ER相關(guān)的蛋白降解（ERAD，ER-associated-protein-degradation）負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài)。

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重組蛋白分泌途徑中的潛在瓶頸

細(xì)胞內(nèi)蛋白的分泌途徑，每一步都受到嚴(yán)格的調(diào)控，以保證蛋白的正確加工和分泌。但當(dāng)目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)錄或者翻譯水平過(guò)高時(shí)，質(zhì)量控制機(jī)制可能會(huì)不堪重負(fù)，導(dǎo)致蛋白分泌受阻。此外，與內(nèi)源性蛋白相比，重組蛋白特別是非天然結(jié)構(gòu)蛋白可能更為復(fù)雜，它在細(xì)胞內(nèi)的正確折疊加工也更具有挑戰(zhàn)性。

重組蛋白在分泌途徑的潛在瓶頸包括新生肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的效率低下，信號(hào)肽的錯(cuò)誤切割，未正確折疊導(dǎo)致的降解或細(xì)胞內(nèi)聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和低效的膜泡運(yùn)輸。多項(xiàng)研究報(bào)告了影響重組蛋白分泌導(dǎo)致蛋白聚集的因素。比如，有研究人員發(fā)現(xiàn)，在多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)程中，信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）復(fù)合物會(huì)造成信號(hào)肽的錯(cuò)誤切割，從而導(dǎo)致輕鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，表達(dá)量低。由于與輕鏈的組裝效率低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重鏈聚集的現(xiàn)象也有所報(bào)道。而重組蛋白的胞內(nèi)累積和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白（ER stress-induced proteins）水平的升高，可能暗示細(xì)胞折疊和分泌能力不足。

對(duì)這些由于分泌途徑限制導(dǎo)致的表達(dá)量低和蛋白聚集問(wèn)題，可以通過(guò)細(xì)胞工程和培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，提高重組蛋白表達(dá)，減少蛋白聚集。

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解決分泌途徑瓶頸的方法

3.1 基因工程

利用基因工程改善分泌途徑，一是通過(guò)設(shè)計(jì)表達(dá)載體；二是調(diào)控參與目標(biāo)蛋白從胞漿中的未成熟蛋白（翻譯后）轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K形式的成熟蛋白的核心分泌機(jī)制基因的表達(dá)?，F(xiàn)階段的研究主要包括新生多肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白折疊和膜泡運(yùn)輸部分。

新生肽鏈向分泌通路的轉(zhuǎn)移由信號(hào)肽引導(dǎo)。信號(hào)肽與胞質(zhì)內(nèi)的信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP，signalrecognition particle）相互結(jié)合并識(shí)別，引導(dǎo)多肽鏈到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，穿過(guò)易位子（Translocon）形成的通道進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，隨即信號(hào)肽被信號(hào)肽酶水解。對(duì)于不同的目的蛋白，選擇合適的信號(hào)肽，對(duì)改善多肽的轉(zhuǎn)移、提高表達(dá)量和阻止肽鏈的錯(cuò)誤剪切有著非常重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)與SRP和易位子亞基共表達(dá)，可以促進(jìn)某些難以表達(dá)（DTE，difficult-to-express）蛋白的正確加工，提高表達(dá)減少蛋白聚集。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)合成加工場(chǎng)所。多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)有大量可溶性的駐留分子伴侶和折疊酶，如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI，protein disulphide isomerase）、BIP、鈣聯(lián)蛋白等，輔助和監(jiān)控多肽的正確折疊和裝配。在某些情況下，比如信號(hào)肽剪切錯(cuò)誤時(shí)，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，由此引發(fā)一系列分子伴侶和折疊酶表達(dá)上調(diào)為標(biāo)志的應(yīng)答反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR，unfolded protein response）。這種現(xiàn)象被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER Stress）。細(xì)胞內(nèi)UPR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)元件有XBP-1，ATF4，ATF6等，在發(fā)生UPR時(shí)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子和折疊酶表達(dá)，提高細(xì)胞處理未折疊蛋白的能力。值得注意的是，如果高水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件持續(xù)存在，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

目前為止，有許多研究者針對(duì)這些參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白加工的基因進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其對(duì)細(xì)胞分泌的影響。多數(shù)研究表明這些基因的調(diào)控對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)具有積極作用，但一些研究則報(bào)道了相反的觀察結(jié)果（見(jiàn)表1）。還有研究者將目光轉(zhuǎn)向了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶保留機(jī)制?？扇苄詢?nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶在細(xì)胞器中的定位是由C端KDEL基序介導(dǎo)的，該基序被KDEL受體識(shí)別。KDEL受體（KDELR，KDEL receptor）是一個(gè)七層跨膜蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和順式高爾基體之間循環(huán)，以pH依賴性方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后腔室捕獲錯(cuò)誤分選的分子伴侶。研究表明，在CHO細(xì)胞過(guò)表達(dá)KDELR1，可以提高特別是生產(chǎn)后期的重組蛋白表達(dá)。

蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊組裝后，通過(guò)膜泡運(yùn)輸?shù)礁郀柣w上，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工形成成熟蛋白，再經(jīng)過(guò)高爾基體小泡運(yùn)輸分泌到胞外。膜泡運(yùn)輸是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白在內(nèi)膜系統(tǒng)各細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)的主要方式，主要包括運(yùn)輸囊泡的出芽、轉(zhuǎn)運(yùn)、拴留、錨定和膜融合過(guò)程。整個(gè)過(guò)程受到許多因子的調(diào)控，如Coat、SM、Tether、SNARE和Rab蛋白等。已有研究表明，無(wú)論是過(guò)表達(dá)促進(jìn)膜泡運(yùn)輸?shù)幕蚧蚯贸?fù)調(diào)控膜泡運(yùn)輸?shù)幕?，?duì)重組蛋白的表達(dá)都顯示了積極影響。

除了上述常用基因工程，最近，microRNA（miRNA）分子也被研究用于改善重組蛋白生產(chǎn)的分泌途徑。miRNA是一類小的非編碼RNA，通常由~22個(gè)核苷酸組成，參與mRNA的表達(dá)調(diào)控。與傳統(tǒng)的基因工程相比，miRNA的優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)靶向調(diào)控多個(gè)基因和通路，提高了基因工程的控制范圍。比如，在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)mitosRNA-1987，抗體的表達(dá)量提高了~60%，這可能是由于mitosRNA-1987同時(shí)下調(diào)了CerS2和Tbc1D20基因的表達(dá)。但同時(shí)，由于miRNA靶標(biāo)眾多，在靶向我們希望的目標(biāo)基因時(shí)，也可能調(diào)控了我們不希望被改變的基因表型。因此，鑒定miRNA的結(jié)合靶標(biāo)并了解其功能，有助于miRNA在細(xì)胞基因工程中的應(yīng)用。

3.2 培養(yǎng)基和工藝優(yōu)化

細(xì)胞在生物反應(yīng)器中容易受培養(yǎng)環(huán)境的影響，包括pH，溫度，滲透壓和溶氧濃度。優(yōu)化工藝條件可以有效的提高重組蛋白表達(dá)量，緩解蛋白聚集。研究表明，pH和溫度的降低，滲透壓的增加，高溶氧濃度都對(duì)表達(dá)量和聚集體的減少顯示出積極作用。

此外，還研究了培養(yǎng)基補(bǔ)充劑對(duì)提高蛋白表達(dá)，緩解聚集的作用。研究表明，改變培養(yǎng)基組成（硫酸銅和半胱氨酸水平）包括小分子化學(xué)伴侶如甘油等可以減少聚集。表明活性劑如吐溫80和海藻糖也可以阻止聚合。此外，將工藝參數(shù)優(yōu)化和培養(yǎng)基/補(bǔ)料補(bǔ)充劑添加相結(jié)合，在提高蛋白表達(dá)，減少聚集展示了良好的前景。

最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)基補(bǔ)充劑對(duì)分泌途徑的影響。比如，當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃降到33℃時(shí)，多個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶表達(dá)水平差異高達(dá)6.7倍。丁酸鈉和丙戊酸通常被認(rèn)為是脫乙?；敢种苿龠M(jìn)有效轉(zhuǎn)錄，提高蛋白表達(dá)。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，它們還可以正調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶和UPR信號(hào)通路元件。

在實(shí)際應(yīng)用中，還可以將基因工程和工藝工程系統(tǒng)地聯(lián)合起來(lái)，以進(jìn)一步提高重組蛋白生產(chǎn)。例如，在DTE Fc融合蛋白，Sp35Fc的瞬時(shí)表達(dá)中，以適當(dāng)比例共轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留伴侶CypB，并在轉(zhuǎn)染后加入0.5mM PBA和1%(v/v)的甘油，可以在12天的培養(yǎng)中使細(xì)胞表達(dá)量顯著提高6倍，并且無(wú)二硫鍵結(jié)合的蛋白聚集。

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其他

目前解決重組蛋白分泌和聚集的方法仍然基于反復(fù)不斷的實(shí)驗(yàn)探索。更全面的了解CHO細(xì)胞中復(fù)雜的分泌和折疊途徑，將有助于指出合理優(yōu)化的方向。測(cè)序技術(shù)和多組學(xué)工作的最新進(jìn)展使我們能夠全面系統(tǒng)的了解細(xì)胞機(jī)制及其與細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)工藝的聯(lián)系。一些研究已經(jīng)將組學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于培養(yǎng)基組成或基因工程，以此進(jìn)行細(xì)胞系性能優(yōu)化。另一方面，基因編輯工具的進(jìn)步，也為分泌途徑中潛在細(xì)胞靶點(diǎn)的驗(yàn)證提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

引用文獻(xiàn)：

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