如果把生物藥研發(fā)-生產(chǎn)-上市這條道路比作一場艱苦卓絕的修行，細(xì)胞株構(gòu)建則是征途之始?；凇百|(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念，我們希望在起點(diǎn)就篩選到一個(gè)“天資卓絕，根骨極佳”的細(xì)胞株，方方面面都符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，避免耗時(shí)費(fèi)力的優(yōu)化工作，使得后續(xù)的上下游工藝開發(fā)（沒錯(cuò)，對下游工藝也很重要）、工藝放大、質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)一片通途。

在評價(jià)細(xì)胞株的各項(xiàng)指標(biāo)中，表達(dá)量高低無疑是通常最受關(guān)注的一項(xiàng)。我們的細(xì)胞株平臺(tái)一年要完成15~20個(gè)左右穩(wěn)定細(xì)胞株項(xiàng)目（附表. 2020年部分穩(wěn)定細(xì)胞株項(xiàng)目類型和表達(dá)量），項(xiàng)目大多為單抗和雙特異性抗體，兼有少量融合蛋白。

就以上分子結(jié)構(gòu)而言，使用CHO-K1細(xì)胞株構(gòu)建平臺(tái)，經(jīng)過10-12周的細(xì)胞株構(gòu)建和篩選過程，14天的CD 培養(yǎng)基Fed-batch培養(yǎng)工藝下，細(xì)胞群表達(dá)量2~6g/L，克隆表達(dá)量4~8g/L是符合預(yù)期的表達(dá)量范圍。當(dāng)然，極少數(shù)的特殊情況下最終的單克隆細(xì)胞株表達(dá)量低于預(yù)期，我們傾向于認(rèn)為該分子相對“Difficult to Express”。從Drug Discovery階段成百上千個(gè)候選分子中，經(jīng)歷一系列篩選及成藥性評估后脫穎而出的一個(gè)或幾個(gè)佼佼者，進(jìn)入到穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建階段后，為什么有的表達(dá)量高，有些表達(dá)量卻還是低于我們的預(yù)期呢？?

眾所周知，外源蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)過程即為外源基因?qū)?轉(zhuǎn)錄-翻譯-蛋白質(zhì)折疊加工分泌的過程。然而宿主細(xì)胞是活的生命體，微米級別的小小生命體內(nèi)運(yùn)行著一套精巧復(fù)雜的自有法則，在大部分常規(guī)的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建過程中，我們往往只能利用脂質(zhì)體、電穿孔等方法進(jìn)行第一步的播種，目的基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后生根發(fā)芽開花結(jié)果等一系列微觀過程則難以掌控。因此，在從基因到蛋白的任意一個(gè)步驟出問題，都有可能影響最終的細(xì)胞株表達(dá)量。

有研究建立了一個(gè)診斷模型來探究造成細(xì)胞株表達(dá)量低的因素，具有一定的參考價(jià)值。對于一個(gè)表達(dá)量低于預(yù)期的Mab A，可選取一個(gè)表達(dá)量正常的Mab B進(jìn)行對照，利用定點(diǎn)整合的方法構(gòu)建細(xì)胞株以最大程度地排除隨機(jī)整合帶來的基因水平異質(zhì)性。接著進(jìn)行如下研究：

01

探究表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞是否有影響

利用四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)（Tet-on），在細(xì)胞群篩選過程中分為”Induced”(+Dox)和“Not Induced”（-Dox）兩組，再分別進(jìn)行單克隆篩選。篩選出的單克隆進(jìn)行Fed-batch，比較不同條件下單克隆之間表達(dá)量、生長、Qp等方面的區(qū)別。在Dox持續(xù)存在下，表達(dá)被激活，表達(dá)產(chǎn)物持續(xù)積累。如若克隆在Dox是否持續(xù)存在下，表現(xiàn)有顯著差別，則可初步判斷因表達(dá)產(chǎn)物的毒性導(dǎo)致細(xì)胞株表達(dá)量低。

02

探究基因轉(zhuǎn)錄水平是否正常

利用qRT-PCR檢測細(xì)胞株輕重鏈mRNA相對表達(dá)水平，與正常表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行比較，如若結(jié)果有顯著性差別，則可初步判斷因轉(zhuǎn)錄水平不足導(dǎo)致細(xì)胞株表達(dá)量低。

03

探究目的蛋白的分泌情況

利用環(huán)乙酰亞胺（cycloheximide，CHX）抑制蛋白質(zhì)翻譯，結(jié)合Dox的作用觀察目的蛋白的分泌、折疊和降解情況。在CHX和Dox共同存在的情況下，目的基因表達(dá)被激活而蛋白質(zhì)合成受到抑制，利用Western Blot檢測培養(yǎng)上清中有無目的蛋白輕重鏈條帶。解除CHX抑制后在固定時(shí)間間隔同步檢測上清中Mab A&B的輕重鏈表達(dá)情況，如二者有顯著性差別，則表明正確折疊和組裝蛋白不能正常分泌到胞外，從而影響細(xì)胞株表達(dá)量。

04

探究目的蛋白的折疊裝配情況

將經(jīng)CHX處理后的細(xì)胞收集裂解，提取胞內(nèi)總蛋白，觀察細(xì)胞內(nèi)部輕重鏈積累情況，同時(shí)關(guān)注BiP的積累。BiP是可與不正確折疊或錯(cuò)誤組裝蛋白結(jié)合，使其停留在未折疊狀態(tài)的一類分子伴侶，其積累水平可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的指征。如觀察到胞內(nèi)輕鏈或重鏈有相對異常積累，且BiP水平相對較高的現(xiàn)象，則可判斷目的蛋白在胞內(nèi)積累導(dǎo)致細(xì)胞株表達(dá)量低于預(yù)期。

在了解造成細(xì)胞株低表達(dá)的因素后，我們通過“先天”的手段，如序列優(yōu)化、表達(dá)載體及宿主細(xì)胞改造等，可以一定程度上提高細(xì)胞株表達(dá)量；“后天”也能通過對細(xì)胞株“私人訂制”的培養(yǎng)工藝在提高表達(dá)量方面取得一些成果。然而，在我們孜孜不倦地追求越來越高的細(xì)胞株表達(dá)量時(shí)，不禁引人思考：細(xì)胞株的表達(dá)量是越高越好嗎？

答案無疑是否定的。表達(dá)量是評價(jià)細(xì)胞株重要卻不唯一的維度，從整個(gè)項(xiàng)目周期來看，F(xiàn)inal Clone的確起到了一錘定音的效果，后續(xù)的工作都必須圍繞著它進(jìn)行，也因此，在敲定最后的細(xì)胞株之前應(yīng)當(dāng)為未來環(huán)節(jié)考慮，挑選生長理想，代謝穩(wěn)定，產(chǎn)物質(zhì)量符合要求的細(xì)胞株，而不是一味追求高表達(dá)量。

此外，基于國內(nèi)藥品集采后的現(xiàn)實(shí)形勢，成本控制顯得尤為重要。有不少研究建立模型以研究抗體產(chǎn)量與生產(chǎn)成本之間動(dòng)態(tài)變化過程。追求高表達(dá)細(xì)胞株的最現(xiàn)實(shí)因素莫過于后續(xù)生產(chǎn)的上游規(guī)模和成本，相對于高表達(dá)細(xì)胞株而言，低表達(dá)細(xì)胞株無疑使得上游成本占主導(dǎo)位置，因此提高表達(dá)量是優(yōu)化上游生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞株蛋白表達(dá)量從0.5g/L增至5g/L，單抗生產(chǎn)成本大幅度降低。然而對于下游而言，在同等發(fā)酵體積下，細(xì)胞株表達(dá)量的提高意味著下游填料量的增大，從而使下游成本迅速提高。

有研究表明，當(dāng)細(xì)胞株表達(dá)量從2 g/L提高到10 g/L時(shí)，下游成本從總支出的48%提高到73%。另有研究指出，當(dāng)表達(dá)量達(dá)到5g/L以上時(shí)，對成本影響減弱，轉(zhuǎn)化為下游過程控制主導(dǎo)。因此，對于當(dāng)下環(huán)境而言，或許更需考慮平衡上下游成本，對于細(xì)胞株的表達(dá)量，也多了一個(gè)重要的現(xiàn)實(shí)考慮因素。

關(guān)于細(xì)胞株表達(dá)量的二三事討論到此就告一段落了，細(xì)胞株表達(dá)量這一簡單而直觀的數(shù)據(jù)背后，還蘊(yùn)藏著許多值得思考和探討的話題，文中的幾個(gè)方面只是冰山一角，海面下隱藏的信息值得繼續(xù)挖掘。通過以上討論，我們能更深切地認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞株構(gòu)建的工作，與其說是在花園里尋找一朵最美麗的玫瑰花，不如說是找到一朵足夠美麗的——美麗，沒有硬傷，這就是我們想要的，適合我們的玫瑰了。

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關(guān)于皓陽生物

杭州皓陽生物技術(shù)有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開發(fā)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建、發(fā)酵工藝開發(fā)、純化工藝開發(fā)、制劑處方開發(fā)、分析方法開發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開發(fā)、培養(yǎng)基定制開發(fā)等多個(gè)藥物開發(fā)平臺(tái)，建有完善的1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專業(yè)CDMO服務(wù)。公司現(xiàn)有研發(fā)實(shí)驗(yàn)室面積5000平方米，總投資近億元。自成立以來，公司為國內(nèi)外多個(gè)新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術(shù)研發(fā)服務(wù)，同時(shí)與多家知名醫(yī)藥公司達(dá)成戰(zhàn)略合作。

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