導(dǎo)語(yǔ)：

補(bǔ)料作為fedbatch的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，一般由消耗量較大的成分組成，如氨基酸、維生素等，其組分濃度高，滲透壓高，在批次補(bǔ)料中至關(guān)重要，開發(fā)極具挑戰(zhàn)性，需要恰當(dāng)?shù)某煞?，適宜的濃度，所謂藝術(shù)難在平衡，在補(bǔ)料開發(fā)上亦是如此。目前市面上的商業(yè)化補(bǔ)料種類并不多，市場(chǎng)基本被業(yè)界的三巨頭（Gibco、Hyclone、Merck）壟斷，迫于進(jìn)口產(chǎn)品居高不下的價(jià)格，以及未來(lái)對(duì)于持續(xù)性供貨的擔(dān)憂，國(guó)產(chǎn)化補(bǔ)料已經(jīng)順勢(shì)崛起。

01

補(bǔ)料的重要性

那補(bǔ)料到底有多重要，小編先貼組數(shù)據(jù)，選擇一款頂尖的商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行batch培養(yǎng)，同時(shí)使用商業(yè)化補(bǔ)料進(jìn)行fedbatch作為對(duì)照組，試驗(yàn)細(xì)胞為表達(dá)某雙抗的CHO-K1單克隆細(xì)胞株。

沒(méi)有什么比數(shù)據(jù)更有說(shuō)服力的了。Batch培養(yǎng)的細(xì)胞也有生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期和凋亡期，但凋亡期活率下降很快，12天活率僅剩82.4%，表達(dá)量是1.24g/L，再看對(duì)照組，第11天的表達(dá)量達(dá)到4.52g/L，第14天活率還有88%?？梢娧a(bǔ)料在細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白表達(dá)上的重要性。接下來(lái)小編又換了一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（皓陽(yáng)培養(yǎng)基），進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。

很明顯，換了基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，補(bǔ)料仍舊不可或缺，但是這次使用皓陽(yáng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)稍有改善，第11天的表達(dá)量有2.91g/L，能達(dá)到對(duì)照組的61%，只是從11天開始表達(dá)量原地不動(dòng)，細(xì)胞只存活，不表達(dá)，也實(shí)在是無(wú)米可用。兩個(gè)小實(shí)驗(yàn)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，同樣是基礎(chǔ)培養(yǎng)基batch培養(yǎng)，生長(zhǎng)及表達(dá)差距甚遠(yuǎn)，可能是基礎(chǔ)中不同的組分及濃度造成了這個(gè)差異，到底是哪些成分的濃度差異導(dǎo)致，由于商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分不明確，這里只能是一個(gè)迷。

02

補(bǔ)料的搭配組合

一般補(bǔ)料為一個(gè)主體補(bǔ)料搭配一個(gè)堿性補(bǔ)料，堿性補(bǔ)料成分比較清晰，為幾個(gè)難溶性氨基酸，如酪氨酸等。小編用僅含氨基酸、維生素和幾個(gè)鹽的補(bǔ)料（皓陽(yáng)補(bǔ)料），以皓陽(yáng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，與上述商業(yè)化補(bǔ)料進(jìn)行了比對(duì)研究。

使用皓陽(yáng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基僅補(bǔ)料商業(yè)補(bǔ)料，不補(bǔ)堿性補(bǔ)料，最后表達(dá)量為2.65g/L，與batch試驗(yàn)中的結(jié)果相當(dāng)甚至更低，前期細(xì)胞生長(zhǎng)與活率維持與另兩組相似，后期維持很差，結(jié)束時(shí)活率甚至低于batch水平，表達(dá)量結(jié)果與batch相似，第11天后就停止表達(dá)，猜測(cè)是商業(yè)化補(bǔ)料中完全不含堿性補(bǔ)料中的某個(gè)或某幾個(gè)氨基酸，導(dǎo)致細(xì)胞前期能利用基礎(chǔ)中的含量進(jìn)行生長(zhǎng)和適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，后期不斷補(bǔ)入的營(yíng)養(yǎng)成分由于無(wú)法利用反而成為了負(fù)擔(dān)。再看皓陽(yáng)補(bǔ)料，不補(bǔ)堿性補(bǔ)料后，表達(dá)量能達(dá)到5.36g/L，而補(bǔ)堿性補(bǔ)料后表達(dá)量為6.04g/L，比例達(dá)到88.7%，可能因?yàn)殚_發(fā)補(bǔ)料中含一定濃度的難溶性氨基酸，但濃度又不夠，有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)，將正常補(bǔ)料中的半胱氨酸濃度降低15%后，抗氧化物谷胱甘肽和?；撬岬葧?huì)減少，導(dǎo)致細(xì)胞在后期維持氧化還原的能力大大降低，活率下降，最終導(dǎo)致蛋白表達(dá)下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

03

補(bǔ)料對(duì)titer影響

皓陽(yáng)補(bǔ)料第14天表達(dá)量有6.04g/L，能達(dá)到商業(yè)補(bǔ)料90%以上的水平，勝利在望，小編不能停下腳步，這次仍使用皓陽(yáng)基礎(chǔ)，將上述補(bǔ)料中20種氨基酸和11種維生素設(shè)了兩個(gè)濃度，大部分氨基酸濃度差異較小，在2-5倍之間，個(gè)別特殊氨基酸如丙氨酸、甘氨酸酪氨酸等濃度設(shè)計(jì)差異較大，達(dá)到6-7倍以上，維生素的濃度差異較寬，在3倍至100倍之間不等，一共設(shè)計(jì)了32組PB（Plackett-Burman）試驗(yàn)，再加一組對(duì)照（33號(hào)，皓陽(yáng)基礎(chǔ)+商業(yè)補(bǔ)料）。

就不吐槽這個(gè)實(shí)驗(yàn)前期培養(yǎng)基配制工作有多復(fù)雜，結(jié)果卻讓小編大失所望，所有實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，最高的只有5.15g/L，只有對(duì)照組的80.7%，而最低的為2.32g/L，連batch的表達(dá)水平都沒(méi)達(dá)到，這細(xì)胞就是這么任性，營(yíng)養(yǎng)不對(duì)胃口，就不吃也不吐。

雖然實(shí)驗(yàn)沒(méi)有預(yù)期的結(jié)果，小編也沒(méi)有挖掘到什么有價(jià)值的信息，只感覺(jué)添加不同濃度氨基酸和維生素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響沒(méi)那么大，但對(duì)蛋白表達(dá)的影響卻非常大，這次小編給自己減負(fù)，將氨基酸濃度卡住不動(dòng)，單獨(dú)對(duì)維生素進(jìn)行了探索，但濃度范圍作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，高低在2-200倍之間，設(shè)計(jì)了12組PB與一組對(duì)照（13號(hào)，皓陽(yáng)基礎(chǔ)+商業(yè)補(bǔ)料）。

先看對(duì)照組，這個(gè)皓陽(yáng)基礎(chǔ)加商業(yè)補(bǔ)料的CP組合，從第二個(gè)實(shí)驗(yàn)的6.54g/L，到第四個(gè)實(shí)驗(yàn)的6.38g/L，再到本次的6.34g/L，可以說(shuō)是非常的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)組活率到第11天為止基本一致，最后一天表現(xiàn)出了較大的差異，第14天最低活率是19%，最高活率有91%，活細(xì)胞密度情況相似，最后一天從22.7E6cells/ml到4.23E6cells/ml，也就是不同的維生素濃度對(duì)細(xì)胞后期的狀態(tài)維持有較大的影響，分析得出結(jié)果對(duì)于活率密度維持及蛋白表達(dá)最重要的一個(gè)因子是氯化膽堿，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

04

補(bǔ)料定制開發(fā)對(duì)宿主的意義

雖然文獻(xiàn)早有報(bào)道，但小編還是暗自驚喜，至少有兩款能與商業(yè)補(bǔ)料媲美的補(bǔ)料， fedbatch最后第14天的表達(dá)量能達(dá)到6.4g/L，于是小編又精神抖擻，繼續(xù)搬磚，這次用表達(dá)另一蛋白的CHOK1單克隆細(xì)胞，選取上述第11（皓陽(yáng)補(bǔ)料1）和第12號(hào)補(bǔ)料（皓陽(yáng)補(bǔ)料2）進(jìn)行了試驗(yàn)。

皓陽(yáng)基礎(chǔ)搭配商業(yè)補(bǔ)料表現(xiàn)依舊出色，表達(dá)量為最高，達(dá)到4.86g/L，但皓陽(yáng)補(bǔ)料無(wú)論是1或2，最后表達(dá)量?jī)H有3.5g/L，有點(diǎn)不忍直視。所以可見，雖為同一宿主細(xì)胞，不同項(xiàng)目之間的差距，揭示了不同項(xiàng)目量身定制化開發(fā)的重要性。

經(jīng)驗(yàn)分享與感悟

直到現(xiàn)在，因?yàn)榧?xì)胞代謝的錯(cuò)綜復(fù)雜，我們對(duì)它的認(rèn)知仍是冰山一角，作為一名工藝人，在開發(fā)路上翻山越嶺，披荊斬棘，只愿所有迷惑，皆為可解。

參考文獻(xiàn)

1.Shinobu Kuwae?,?Ichiko Miyakawa?,?Tomohiro Doi?, Development of a chemically defined platform fed-batch culture media for monoclonal antibody-producing CHO cell lines with optimized choline content. Cytotechnology .2018 Jun;70(3):939-948.? ? ? ?

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關(guān)于皓陽(yáng)生物

杭州皓陽(yáng)生物技術(shù)有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開發(fā)服務(wù)的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建、發(fā)酵工藝開發(fā)、純化工藝開發(fā)、制劑處方開發(fā)、分析方法開發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開發(fā)、培養(yǎng)基定制開發(fā)等多個(gè)藥物開發(fā)平臺(tái)，建有完善的1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專業(yè)CDMO服務(wù)。公司現(xiàn)有研發(fā)實(shí)驗(yàn)室面積5000平方米，總投資近億元。自成立以來(lái)，公司為國(guó)內(nèi)外多個(gè)新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術(shù)研發(fā)服務(wù)，同時(shí)與多家知名醫(yī)藥公司達(dá)成戰(zhàn)略合作。

?皓陽(yáng)生物致力于通過(guò)新藥研發(fā)，推動(dòng)生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新為民、科技惠民的創(chuàng)業(yè)目標(biāo)。公司立足中國(guó)，實(shí)踐?“聆聽 深耕 開拓 共贏”的企業(yè)精神，努力打造一個(gè)行業(yè)地位突出，管理先進(jìn)的現(xiàn)代化企業(yè)。