如果將下游工藝開(kāi)發(fā)看成是爬山，那么陽(yáng)離子層析可以算是最難跨過(guò)的山峰之一。陽(yáng)離子工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程可能會(huì)遇到單抗洗脫有兩個(gè)洗脫峰的情況，小編在某項(xiàng)目中就遇到了這一現(xiàn)象，進(jìn)而對(duì)雙峰出現(xiàn)的原因和解決方法進(jìn)行了文獻(xiàn)查閱和實(shí)驗(yàn)探索。

01 陽(yáng)離子層析洗脫雙峰現(xiàn)象

Jing Guo[1], Haibin Luo[2]?等在研究中發(fā)現(xiàn)，某些抗體陽(yáng)離子層析工藝開(kāi)發(fā)時(shí)出現(xiàn)洗脫峰雙峰現(xiàn)象（圖1A）[2]；將A中的兩個(gè)峰分別收集、透析后重復(fù)陽(yáng)離子層析過(guò)程，發(fā)現(xiàn)兩者洗脫圖譜峰形相同（圖1 B）[2]，且依然呈現(xiàn)雙洗脫峰現(xiàn)象，即雙峰組分無(wú)明顯差異；研究者進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，在不同上樣載量條件下，洗脫圖譜均為相似的雙峰（圖1 C）[2]。這與小編在項(xiàng)目推進(jìn)中遇到的情況非常相似。

02 陽(yáng)離子層析出現(xiàn)雙峰原因

Haibin Luo[2]?等進(jìn)一步探究了抗體陽(yáng)離子層析出現(xiàn)雙洗脫峰的原因：組氨酸存在于絕大多數(shù)抗體蛋白中，而組氨酸基團(tuán)在不同pH緩沖液條件下帶電情況也會(huì)不同。一個(gè)組氨酸殘基的平均pKa是6.0，但組氨酸殘基在疏水環(huán)境中通常具有更低pKa和較慢的質(zhì)子化速率。焦碳酸二乙酯(DEPC)可特異性結(jié)合溶劑和蛋白質(zhì)表面未質(zhì)子化的組氨酸殘基，而羥胺可以去除DEPC對(duì)組氨酸的修飾（圖2A）[2]；DEPC對(duì)組氨酸的修飾過(guò)程及羥胺的去組氨酸DEPC修飾過(guò)程均不會(huì)對(duì)抗體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，可通過(guò)質(zhì)譜確定被DEPC修飾的組氨酸位點(diǎn)，且DEPC修飾不會(huì)對(duì)蛋白紫外吸收造成影響（圖2D）[2]，即可通過(guò)組氨酸DEPC修飾/去修飾來(lái)研究組氨酸對(duì)抗體陽(yáng)離子層析出現(xiàn)雙洗脫峰的影響。如圖2B、2C所示，選擇不同時(shí)間/程度的組氨酸DEPC修飾及去DEPC修飾的抗體產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子層析，可見(jiàn)隨著組氨酸DEPC修飾時(shí)間/程度的增加，洗脫雙峰現(xiàn)象有所變化直至消失（圖C3基本呈現(xiàn)單洗脫峰）[2]；而隨著羥胺的去組氨酸DEPC修飾時(shí)間/程度的增加，雙峰現(xiàn)象重新出現(xiàn)。上述實(shí)驗(yàn)證明抗體序列中的組氨酸是導(dǎo)致抗體陽(yáng)離子層析雙洗脫峰的因素。

如圖3A[2]顯示，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，1號(hào)組氨酸殘基位于可變結(jié)構(gòu)域，2-10號(hào)組氨酸殘基位于恒定結(jié)構(gòu)域（大多數(shù)單抗都有，但陽(yáng)離子層析多數(shù)未表現(xiàn)出雙峰現(xiàn)象）。使用F(ab’)2蛋白酶切除Fc Region后，對(duì)酶切產(chǎn)物F(ab’)2 進(jìn)行陽(yáng)離子層析純化時(shí)，同樣出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象（圖3B）。該結(jié)果表明F(ab’)2的組氨酸很有可能是導(dǎo)致陽(yáng)離子層析雙洗脫峰的因素，但是并不能確定是可變結(jié)構(gòu)域的1號(hào)組氨酸還是恒定結(jié)構(gòu)域的2-5號(hào)組氨酸的影響。

03 陽(yáng)離子層析雙峰解決策略

3.1.陽(yáng)離子填料篩選

Haibin Luo[2]等發(fā)現(xiàn)，在相同層析洗脫條件（50mM NaAc，NaCl梯度洗脫）下，使用不同的層析填料會(huì)有不同的色譜表現(xiàn)：如POROS 50HS和Fractogel SO3-(M)陽(yáng)離子洗脫出現(xiàn)兩個(gè)峰，Nuvia S和Source 30S出現(xiàn)肩峰，而Toyopearl SP 650M為單洗脫峰（圖4），即可通過(guò)填料篩選避免工藝中雙峰的產(chǎn)生。

但是詳細(xì)對(duì)比這幾種填料的具體信息表1，小編發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子洗脫雙峰現(xiàn)象和填料的基質(zhì)或配基沒(méi)有必然的聯(lián)系，應(yīng)該是一種綜合的影響：如Fractogel SO3-(M)和Toyoperal SP 650M的填料基質(zhì)都是聚甲基丙烯酸酯，而一個(gè)洗脫有雙峰另一個(gè)沒(méi)有。Source 30S和Sepharose SP配基相同一個(gè)洗脫峰雙峰另一個(gè)是肩峰。

3.2洗脫Buffer的選擇

如上所述，小編在某抗體項(xiàng)目陽(yáng)離子工藝開(kāi)發(fā)也遇到了雙峰現(xiàn)象，將兩個(gè)峰分別收集檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)量沒(méi)有顯著差異。因?yàn)榉N種原因，本項(xiàng)目無(wú)法更換不同基質(zhì)或配基的填料，且通過(guò)改變上樣及洗脫pH（圖5a）、增加低鹽淋洗（圖5b）等均無(wú)法完全避免雙峰的情況。通過(guò)進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，小編發(fā)現(xiàn)精氨酸可以改變蛋白和填料作用力，于是嘗試了一下發(fā)現(xiàn)洗脫液中添加一定濃度的精氨酸，確實(shí)可以避免陽(yáng)離子層析雙洗脫峰的產(chǎn)生（圖5c、5d）；該工藝經(jīng)中試250L培養(yǎng)體積的下游純化生產(chǎn)驗(yàn)證，證明工藝穩(wěn)定性及可放大性良好。

關(guān)于精氨酸和抗體相互作用從而影響抗體洗脫的原理也有很多研究和報(bào)道［3］。精氨酸含有胍基團(tuán)和一個(gè)兩性分子，有研究者對(duì)比研究了胍和精氨酸對(duì)蛋白層析表現(xiàn)的影響。圖6 a顯示的是胍對(duì)研究蛋白在Capto MMC層析洗脫的鹽濃度的影響：根據(jù)圖a中黑色和灰色高度對(duì)比，可見(jiàn)加入0.035M 胍濃度對(duì)層析洗脫鹽濃度有較大影響，部分蛋白洗脫鹽濃度增加，部分蛋白洗脫鹽濃度降低；b顯示的精氨酸對(duì)研究蛋白在Capto MMC層析洗脫鹽濃度影響：可見(jiàn)在加入0.035M 精氨酸后多數(shù)蛋白洗脫鹽濃度顯著降低，即精氨酸對(duì)洗脫鹽濃度有顯著影響，可以降低蛋白洗脫的鹽濃度。a和b的對(duì)比說(shuō)明精氨酸中的胍基對(duì)蛋白的色譜表現(xiàn)有一定影響，但精氨酸整體分子對(duì)蛋白洗脫的的影響作用更加具有規(guī)律性，Capto MMC層析中能夠降低蛋白的洗脫鹽濃度。

Siddharth Parimal,等利用分子動(dòng)力學(xué)（Molecular Dynamics,MD）模擬研究胍和精氨酸與蛋白質(zhì)的相互作用，圖7［3］結(jié)果顯示胍和精氨酸會(huì)與蛋白表面帶正負(fù)電的基團(tuán)同時(shí)存在相互作用，進(jìn)而影響蛋白的表面電荷分布。

Siddharth Parimal還通過(guò)電荷間相互作用來(lái)分析胍和精氨酸對(duì)蛋白和填料結(jié)合的影響。精氨酸和胍都含有帶正電荷的基團(tuán)。胍和精氨酸分子的胍基與Capto MMC配體有靜電相互作用。圖8 a顯示沒(méi)有精氨酸和胍添加的蛋白和填料相互作用，蛋白只有帶正電基團(tuán)能與填料相結(jié)合；圖8 b顯示胍對(duì)蛋白和填料相互作用，胍?guī)д娍梢苑謩e結(jié)合填料和蛋白的負(fù)電基團(tuán)，改變填料和蛋白之間的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響蛋白和填料的相互作用力。對(duì)不同性質(zhì)的蛋白起到增大或減少與填料結(jié)合力的效果；圖8 c顯示精氨酸也可以同時(shí)結(jié)合蛋白或者填料。由于精氨酸分子比胍分子大很多，精氨酸與蛋白結(jié)合后由于空間位阻會(huì)導(dǎo)致蛋白無(wú)法和填料相結(jié)合，降低了蛋白和填料之間的結(jié)合力，使蛋白可以更低的鹽濃度洗脫。

Siddharth Parimal用分子動(dòng)力學(xué)和電荷相互作用分析精氨酸和胍會(huì)和蛋白的表面帶電基團(tuán)相互作用，結(jié)果表明在層析時(shí)加入精氨酸和胍會(huì)改變蛋白和填料之間的結(jié)合作用力。精氨酸由于分子較大同時(shí)帶有正負(fù)電基團(tuán)對(duì)蛋白結(jié)合影響更顯著，可降低陽(yáng)離子層析蛋白洗脫的鹽濃度。

04 總結(jié)

抗體陽(yáng)離子層析出現(xiàn)雙洗脫峰，可能與抗體序列中組氨酸有關(guān)系?？梢試L試通過(guò)篩選不同的填料來(lái)解決；也可嘗試在洗脫液中加入精氨酸或直接精氨酸洗脫，通過(guò)改變蛋白和填料的結(jié)合力，來(lái)避免雙洗脫峰的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)

[1]Jing G , Creasy A D , Barker G , et al. Surface induced three-peak elution behavior of a monoclonal antibody during cation exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1474:85-94

[2]Luo H , ?Cao M , ?Newell K , et al. Double-peak elution profile of a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused by histidine-protonation-based charge variants[J]. Journal of Chromatography A, 2015.

[3]?Parimal S , ?Garde S , ?Cramer S M .?Effect of guanidine and arginine on protein-ligand interactions in multimodal cation-exchange chromatography.[J]. Biotechnology Progress, 2016.

關(guān)于皓陽(yáng)生物

杭州皓陽(yáng)生物技術(shù)有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開(kāi)發(fā)服務(wù)的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建、發(fā)酵工藝開(kāi)發(fā)、純化工藝開(kāi)發(fā)、制劑處方開(kāi)發(fā)、分析方法開(kāi)發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開(kāi)發(fā)、培養(yǎng)基定制開(kāi)發(fā)等多個(gè)藥物開(kāi)發(fā)平臺(tái)，建有完善的250L,500L,1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線(xiàn)，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專(zhuān)業(yè)CDMO服務(wù)。公司現(xiàn)有研發(fā)實(shí)驗(yàn)室面積8000平方米，總投資1.5億元。自成立以來(lái)，公司為國(guó)內(nèi)外多個(gè)新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術(shù)研發(fā)服務(wù)，同時(shí)與多家知名醫(yī)藥公司達(dá)成戰(zhàn)略合作。

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