CHO細(xì)胞作為治療性抗體表達(dá)的最主要宿主細(xì)胞系，目前70%以上的治療性抗體都是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)的。同樣的以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)是當(dāng)下對細(xì)胞基因組進(jìn)行靶向改造的最簡單最有效的方法。因此，通過基因編輯技術(shù)對CHO細(xì)胞進(jìn)行工程改造應(yīng)運(yùn)而生。

01基因編輯簡介

上世紀(jì)50年代沃森和克里克提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型以來，分子生物學(xué)的快速發(fā)展，讓我們對基因的了解從宏觀推進(jìn)到了分子層面。而以上世紀(jì)90年代鋅指核酸酶（ZFN,Zinc finger nuclease)基因編輯技術(shù)的發(fā)明為起點(diǎn)，直到本世紀(jì)初TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）以及CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)的相繼發(fā)明，則讓我們?nèi)祟惖靡愿`取了一絲上帝造物的權(quán)柄。

目前的基因編輯技術(shù)分為兩類：CRISPR/Cas9，以及其它。CRISPR/Cas9技術(shù)自誕生以來，以其無與倫比的簡單，高效，快捷等特點(diǎn)，成為了當(dāng)前最“炙手可熱”的基因編輯工具。2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)和NCBI上多達(dá)15000篇的相關(guān)論文已經(jīng)說明了一切。鑒于該技術(shù)詳盡的介紹在搜索引擎上隨處可見，我無意在此多費(fèi)筆墨，請讀者們自行查閱。

典型的基因編輯工具都由兩個(gè)功能域組成：一個(gè)由氨基酸（ZFN,TALEN）或RNA（CRISPR/Cas9）介導(dǎo)的可編碼的序列特異性DNA結(jié)合模塊，負(fù)責(zé)對靶序列的識別；一個(gè)具有DNA內(nèi)切酶活性的可切割DNA雙鏈的模塊，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks, DSBs)。DSBs出現(xiàn)后，細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制啟動，對斷裂的雙鏈進(jìn)行同源（Homology directed repair, HDR)或非同源末端修復(fù)（Non-homologous end joining, NHEJ)。非同源末端修復(fù)極易出錯(cuò)，會帶來堿基的缺失或插入，導(dǎo)致移碼突變或者終止密碼子出現(xiàn)，由此對基因功能造成破壞，達(dá)到基因敲除的目的。而轉(zhuǎn)入帶有DNA雙鏈斷裂兩端同源臂的修復(fù)模板（Repair template），則可通過同源末端修復(fù)達(dá)到外源基因的定點(diǎn)插入。

02抗體的ADCC效應(yīng)與巖藻糖修飾

抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）是指抗體的Fab段結(jié)合病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的抗原表位，其Fc段與殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）表面的Fc受體結(jié)合，介導(dǎo)殺傷細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞。抗體通常通過鉸鏈區(qū)及CH2區(qū)域和Fcγ受體結(jié)合。CH2結(jié)構(gòu)域的Asn-N297糖基化位點(diǎn)的糖型成分（如乙酰葡糖胺，甘露糖，巖藻糖和唾液酸等）決定CH2結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及結(jié)合特性。有研究顯示降低Asn 297的巖藻糖修飾比例可顯著增加抗體對殺傷細(xì)胞上CD16（Fcγ受體IIIa）的親和力，并最終增加ADCC效應(yīng)。

通過在CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中添加抗體巖藻糖基化通路上相關(guān)酶的抑制劑或者巖藻糖類似物（如2FF）能降低抗體的巖藻糖基化水平，但是對于不同的抗體分子，往往需要通過優(yōu)化添加劑的添加時(shí)間以及添加濃度才能達(dá)到理想的巖藻糖基化水平，并且在細(xì)胞工藝放大過程中的穩(wěn)定性也有待考察。此外這些添加劑往往價(jià)格高昂，會顯著提升生產(chǎn)成本。

03基因編輯技術(shù)敲除CHO細(xì)胞fut8基因

如何才能快速穩(wěn)定的生產(chǎn)低巖藻糖基化的抗體？我們通過查閱文獻(xiàn)注意到抗體的巖藻糖基化是糖蛋白翻譯后修飾的一個(gè)普遍過程，核心巖藻糖基化即向N-糖鏈的核心五糖結(jié)構(gòu)(GlcNAc2Man3)還原端第一個(gè)N-乙酰葡糖胺上添加一個(gè)α-1,6連接的巖藻糖，而巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Fut8，是唯一一個(gè)能催化形成α-1,6巖藻糖苷鍵的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。因此，如果能敲除CHO細(xì)胞基因組內(nèi)表達(dá)該酶的基因，CHO細(xì)胞即可生產(chǎn)理論上無巖藻糖修飾的抗體。

據(jù)此，我們采用基因編輯技術(shù)，敲除了CHO-K1細(xì)胞基因組內(nèi)的兩個(gè)fut8等位基因。利用敲除fut8基因后的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，并評估抗體的表達(dá)量和巖藻糖基化水平。

從上述數(shù)據(jù)我們可以看出，野生型的CHO-K1細(xì)胞系通過平臺工藝表達(dá)的抗體，巖藻糖基化水平在75%以上；通過2FF工藝，巖藻糖基化水平在15%以下；而fut8基因敲除的細(xì)胞系Fut8-KO-CHO-K1采用平臺工藝表達(dá)的抗體其巖藻糖基化水平穩(wěn)定保持在1.5%以下。從多個(gè)不同項(xiàng)目分子，我們可以發(fā)現(xiàn)無論是采用2FF工藝，還是用Fut8-KO-CHO-K1細(xì)胞，其表達(dá)量都明顯低于采用平臺工藝的CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)量，推測是由于巖藻糖比例降低，影響了細(xì)胞內(nèi)與抗體轉(zhuǎn)錄、翻譯或者分泌相關(guān)的蛋白的活性，從而導(dǎo)致整體表達(dá)量降低。從mAb2，mAb3項(xiàng)目我們可以看到，F(xiàn)ut8-KO-CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)水平不低于采用2FF工藝的野生型CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)水平，這可以證明fut8基因的缺失，并未從其它方面影響CHO細(xì)胞的生理活動。

04結(jié)語

當(dāng)前，工業(yè)界仍習(xí)慣于通過隨機(jī)整合的方式來構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過培養(yǎng)工藝優(yōu)化的方式來提高抗體的表達(dá)量和質(zhì)量，然而，隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，其操作越來越簡單、高效。通過外源基因定點(diǎn)插入轉(zhuǎn)錄熱點(diǎn)區(qū)域來構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，或者通過基因編輯技術(shù)來敲入或敲除抗體轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、分泌等相關(guān)的基因來調(diào)節(jié)抗體的表達(dá)量和質(zhì)量，這些方法的開發(fā)和研究正在如火如荼的進(jìn)行，想必不久的將來會在工業(yè)界得到良好的應(yīng)用。本文通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)能表達(dá)低巖藻糖修飾水平蛋白的CHO細(xì)胞系，就提供了一個(gè)很好的例子。

END

關(guān)于皓陽生物

杭州皓陽生物技術(shù)有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開發(fā)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建、發(fā)酵工藝開發(fā)、純化工藝開發(fā)、制劑處方開發(fā)、分析方法開發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開發(fā)、培養(yǎng)基定制開發(fā)等多個(gè)藥物開發(fā)平臺，建有完善的250L,500L,1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專業(yè)CDMO服務(wù)。公司現(xiàn)有研發(fā)實(shí)驗(yàn)室面積8000平方米，總投資1.5億元。自成立以來，公司為國內(nèi)外多個(gè)新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術(shù)研發(fā)服務(wù)，同時(shí)與多家知名醫(yī)藥公司達(dá)成戰(zhàn)略合作。

皓陽生物致力于通過新藥研發(fā)，推動生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新為民、科技惠民的創(chuàng)業(yè)目標(biāo)。公司立足中國，實(shí)踐?“聆聽 深耕 開拓 共贏”的企業(yè)精神，努力打造一個(gè)行業(yè)地位突出，管理先進(jìn)的現(xiàn)代化企業(yè)。